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全基因合成常見問題解答
合肥博美生物科技有限責任公司 / 2015-03-02

 

                                                                               全基因合成常見問題解答
 
1.堿基序列對全基因合成的影響 
1. 長片段重復。大量的長片段重復很可能會延長基因合成的時間,甚至導致基因完全無法合成。 
2. 高GC%。基因內部的局部高GC%會嚴重影響PCR擴增和測序。 
3. 二級結構。堿基序列的反轉、重疊等會嚴重影響PCR擴增,在測序時也可能會因此而測不通或信號突然中斷等。 
4. 測序引物與基因內部的特殊序列結合導致無法正常測序,必須重新設計測序引物。 
對策: 對密碼子進行優化,盡量減少基因序列中的重復序列,高GC%區和二級結構區。 
 
2.PCR出現非特異性擴增帶 
1. 引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。 
2. Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環次數過多。 
3. 酶量過多出現非特異性擴增。 
對策: 
1. 重新設計引物。 
2. 減低酶量或調換另一來源的酶。 
3. 降低引物量,適當增加模板量,減少循環次數。 
4. 適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93變性,65左右退火與延伸)。 
 
3.PCR出現片狀拖帶或涂抹帶 
1. 酶量過多或酶的質量差。 
2. dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環次數過多。 
對策: 
1. 減少酶量,或調換另一來源的酶。 
2. 減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度,減少循環次數。 
 
4. DNA沒有被限制性內切酶切開或者切割不完全 
1. 缺少識別序列。 
2. 反應條件不合適。 
3. 限制性內切酶對DNA甲基化敏感。 
4. 內切酶稀釋不正確或加入方法不正確。 
5. 甘油濃度過高。 
6. 限制性內切酶已部分或全部失活。 
對策: 
1. 檢查底物DNA中是否存在可被限制酶識別的DNA序列。 
2. 使用隨酶提供的反應緩沖液;增大酶量。 
3. 檢查DNA是否已被甲基化以及所用的限制性內切酶是否對甲基化敏感。 
4. 限制性內切酶經稀釋緩沖液稀釋后應在當天用完;限制性內切酶通常在最后加入。 
5. 更換新酶進行實驗。 
6. 酶的體積不能超過反應總體積的1/10。 
 
5.電泳后電泳條帶擴散,電泳條帶移動距離異常 
1. 底物DNA不純。 
2. 限制性內切酶不純。 
3. 酶蛋白自身或其它雜蛋白與DNA結合在一起使電泳條帶移動距離異常。 
對策: 
1. 用另外一種限制性內切酶與底物DNA溫育作為對照 
2. 用產品說明中的底物DNA來檢測酶活性,如果電泳后條帶仍擴散,說明不正確的操作已使內切酶污染。 
3. 電泳前用終濃度為0.1%的SDS在65與底物DNA溫育10min。 
 
6.連接效率不高 
1. 連接緩沖液已變質。 
2. 限制性內切酶在連接混合物中仍具活性。 
3. 非特異性的核酸酶污染。 
4. 連接酶濃度太低。 
對策: 
1. 用新鮮的連接緩沖液重新進行連接反應。 
2. 如果限制性內切酶在65溫育下熱穩定,酶切后應該用酚來去除去蛋白并用乙醇沉淀DNA。 
3. 判斷連接反應混合物中哪種組分被污染,然后逐一將其替換。 
4. 在連接反應中增大連接酶的用量(0.3-0.6 Wu/1μg),并同時使用10%PEG。酶切后用酚抽提底物DNA中的蛋白。 
 
7.質粒及其菌株的運輸保存 
我們為您提供含有完全正確的基因序列的質粒(不少于1ul)、甘油菌(含40%甘油)和穿刺菌各一份。在運輸過程中,質粒、甘油菌和穿刺菌均須保證低溫運輸。在實驗室內,穿刺菌應在0~4保存;甘油菌應在-70以下保存;質粒應在-20以下保存,并盡量避免反復凍溶。 
 
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