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細胞培養常見問題及其解決方法
合肥博美生物科技有限責任公司 / 2015-03-02

 

                                                                                         細胞培養常見問題及其解決方法
 
1.如何選用特殊細胞系培養基? 
培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之,首選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始。 
2. 何時須更換培養基? 
視細胞生長密度而定, 或遵照細胞株基本數據上之更換時間,按時更換培養基即可。  
3. 可否使用與原先培養條件不同之培養基? 
不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之
細胞培養基, 若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基, 細胞大都無法立即適應, 造成細胞無法存活。 
4 可否使用與原先培養條件不同之血清種類? 
不能。血清是
細胞培養上一個極為重要的營養來源,所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清, 在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。  
5 何謂FBS, FCS, CS, HS ?  
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 兩者都是指胎牛血清, FCS 乃錯誤的使用字眼, 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。  
6 培養細胞時應使用5 % 或10% CO2?或根本沒有影響?  
一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統, 而培養基中NaHCO3 的含量將決定
細胞培養時應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時,細胞培養時應使用10 % CO2;當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時, 則應使用5 % CO2 培養細胞。 
7.Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養箱。原因是什么?Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)和Earle’s平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別?  
HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中,溶液會變堿,Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織,需要用Eagles液,。如果僅僅是清洗將要在
細胞培養基中儲存的組織,用Hanks液就可以了。 
8. 細胞之接種密度為何?  
依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。
9. 懸浮性細胞應如何繼代處理?  
一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中, 稀釋細胞濃度即可, 若培養液太多時, 可將培養角瓶口端稍微抬高, 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶, 加入新鮮培養基稀釋至適當濃度, 重復前述步驟即可。 
10.冷凍管應如何解凍?  
取出冷凍管后, 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍, 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化, 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿, 否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時, 必須注意安全, 預防冷凍管之爆裂。 
11. 細胞冷凍管解凍培養時, 是否應馬上去除DMSO?  
除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外, 絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞), 在解凍之后, 應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中, 待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可, 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。 
12. 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度?應如何處理?  
一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中, 保存于–20 °C,避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低, 并可減少污染之機會。  
13.欲將一般動物細胞離心下來,其離心速率應為多少轉速?  
欲回收動物細胞, 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm),5 - 10 分鐘, 過高之轉速, 將造成細胞死亡。  
14. 細胞冷凍培養基之成份為何?  
動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意:由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能, 故不可將DMSO 直接加入細胞液中, 必須使用前先行配制完成。  
15.DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何?  
冷凍保存使用之DMSO 等級, 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650), 其本身即為無菌狀況, 第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中, 保存于4°C, 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質, 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO, 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。  
16.冷凍保存細胞之方法?  
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。 
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時, 以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微 降低一些。  
17. 細胞欲冷凍保存時, 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度?  
冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial, 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。
18.培養基中是否須添加抗生素?  
除于特殊篩選系統中外, 一般正常培養狀態下, 培養基中不應添加任何抗生素。 
19.應如何避免細胞污染?  
細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之最好方法。  
20.如果細胞發生微生物污染時,應如何處理?  
原則上:直接滅菌后丟棄之。  
當重要的培養污染時,研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母,把污染細胞與其它細胞系隔離開,用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺,檢查HEPA過濾器。 
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性,因而,做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。 
1.在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞,稀釋到常規細胞傳代的濃度。 
2.分散細胞懸液到多孔培養板中,或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內,把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。 
3.每天觀測細胞毒性指標,如脫落,出現空泡,匯合度下降和變圓。 
4.確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2~3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2~3代。 
5.在無抗生素的培養基中培養細胞一代。 
6.重復步驟4。 
7.在無抗生素的培養基中培養4~6代,確定污染是否以已被消除。 
21.支原體(mycoplasma) 污染的細胞, 是否能以肉眼觀察出異狀?  
不能。除極有經驗之專家外,大多數遭受支原體污染的細胞株, 無法以其外觀分辨之。  
22.支原體污染會對細胞培養有何影響?  
支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數, 代謝及研究之任一數據。故進行實驗前,必須確認細胞為mycoplasma-free,實驗結果之數據方有意義。 
23. 偵測出細胞株有支原體污染時, 該如何處理?  
直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細胞株。
24. CO2 培養箱之水盤如何保持清潔?  
定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。  
25.為何培養基保存于4 °C 冰箱中, 顏色會偏暗紅色, 且pH值會越來越偏堿性?  
培養基保存于4 °C 冰箱中, 培養基內之CO2 會逐漸溢出,造成培養基越來越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果, 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時, 可以通入無菌過濾之CO2, 以調整pH 值。  
26. 各種細胞培養用的dish,flask是否均相同?  
不同廠牌的dish 或flask, 其所coating 的polymer 不同, 制造程序亦不同, 雖對大部分細胞沒有太大之影響, 惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。 
27. 購買之細胞冷凍管經解凍后,為何會發生細胞數目太少之情形?  
研究人員在冷凍細胞之培養時出現細胞數目太少, 大都是因為離心過程操作上的失誤, 造成細胞的物理性損傷, 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心, 應待細胞生長隔夜后再更換培養基即可。  
28.購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因?  
研究人員在
細胞培養時出現存活率不佳, 常見原因可歸納為:培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后, 加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于–80 °C 太久。  
29. 收到之冷凍管瓶身破裂,瓶蓋有裂紋,或瓶蓋脫落之原因?  
冷凍管瓶蓋裂紋,或瓶身破裂,可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當,造成冷凍管裂損,建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫,乃因熱脹冷縮之物理現象,冷凍管有可能因此而造成細胞污染,故冷凍管于放入和取出液氮桶時,均應立刻將冷凍管再一次扭緊。  
30.L-谷氨酰胺在
細胞培養中重要嗎?它在溶液中不穩定嗎?  
L-谷氨酰胺在
細胞培養時是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解,但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成,而氨對于一些細胞具有毒性。zzzzzz 
31.GlutaMAX-I是什么?培養細胞如何利用GlutaMAX-I?這個二肽有多穩定?  
GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物,其不穩定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。 
GlutaMAX-I二肽非常穩定,即使在121磅滅菌20分鐘,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎完全降解。 
32.什么培養基中可以省去加酚紅?  
酚紅在培養基中用作PH值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類反應,培養細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養基。 
33.如何用臺盼蘭計數活細胞?  
用無血清培養基把細胞懸液稀釋到200~2000個/毫升,在0.1毫升細胞懸液中加0.1毫升0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻,數分鐘后,用血球計數板計數細胞。活細胞排斥臺盼蘭,因而染成藍色細胞是死細胞。 
34.培養基中丙酮酸鈉的作用是什么?  
丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源,盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細胞也可以代謝丙酮酸鈉。 
35.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么?  
二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前,用EDTA清洗細胞,以消除來自培養基中所有的二價離子。 
36.室溫下配制的Tris-HCl溶液,在37使用時PH值是多少?  
緩沖液PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4,25,37時,不同PH值。 
50mM Tris-HC 溶液在4,25,37時,不同PH值 

4°C 
25°C 
37°C 
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5
8.6
8.7
8.8
8.9
9.0
9.1
9.2
9.3
9.4
8.5
7.6
7.7
7.8
7.9
8.0
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5
8.6
8.7
8.8
7.2
7.3
7.4
7.5
7.6
7.7
7.8
7.9
8.0
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5


37.如何從T25瓶中轉移sf9細胞?能用胰蛋白酶消化嗎? 
我們推薦使用脫落細胞的方法,此技術破壞性最小,生活力最高。通過使用巴斯德吸液管,讓細胞上培養基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養瓶。只有在絕對必要的情況下,才使用胰酶消化細胞。 
38.胰酶消化一個T25瓶的sf9細胞: 
1. 去除培養基。 
2. 用2ml 1xPBS(足以覆蓋細胞表面)洗滌細胞,去除PBS。 
3. 加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好覆蓋細胞表面)。 
4. 37 孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。 
5. 向細胞中加入2ml 細胞培養液,移入錐形管,用2ml培養液洗瓶壁,移入同一錐形管中。(培養基中的FBS終止了胰酶的活性。) 
6. 離心(1100rpm)沉淀細胞。去除培養基。 
7. 用新的培養基重新懸浮細胞。傳代。 
39.在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養時,肝素的使用量是多少? 
為了防止懸浮培養細胞聚集的形成,使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。 
40.在重新凍存sf9細胞前,它可以傳多少代?隨著傳代的次數的增加,它的感染能力會降低嗎? 
通常情況當細胞經過30次傳代后,應該返回凍存。無論什么時候計數時,都應該檢查細胞活力。如果超過95%的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍,細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降,它們的感染力將不在是有效的。 
41.貯存在冰箱中的瓶口已開的培養基,在放置幾天后顏色變紫? 
這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時,碳酸氫納導致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口,在CO2培養箱孵育培養基10-15分鐘,來校正溶液的pH值(確定松開瓶口以保證氣體交換)。 
42. 
細胞培養基偶然被凍,可否繼續使用? 
如果
細胞培養基偶然被凍,您應該熔化培養基并觀察是否有沉淀產生。如果沒有沉淀產生,培養基可以正常使用,如果出現沉淀,只能丟棄這些培養基。 
43. 無血清培養與有血清培養使用的抗生素量一樣嗎? 
當在無血清培養基中添加抗生素時,降低至少在有血清培養基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結合和滅活一些抗生素。在無血清培養條件下,抗生素不被滅活,可能對于細胞達到毒性水平。
44. 培養基中添加了血清和抗生素后,可長期保存嗎? 
一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時,您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。 
45.培養基及其它添加物和試劑可反復凍融嗎? 
大部分添加物和試劑最多可以凍融3次,如果次數更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,將會影響它的性能。 
46.為什么要在溶解的一周內使用貯存在4冰箱中的液體胰蛋白酶溶液? 
胰蛋白酶在4就可能開始降解,如果在室溫下放置超過30分鐘,就會變得不穩定。 
47.保存血清最好的方法? 
我們建議血清應保存在-5至-2O。若存放于4時,請勿超過一個月。若一次無法用完一瓶,建議無菌分裝血清至恰當的滅菌容器內,再放回冷凍。 
48. 如何解凍血清才不會使產品質量受損? 
將血清從冷凍箱取出后,先置于2~8冰箱使之融解,然后在室溫下使之全融。但必須注意的是,融解過程中必須規則地搖晃均勻。 
49. 血清解凍后發現有絮狀沉淀物出現,該如何處理? 
血清中沉淀物的出現有許多種原因,但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成,而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后,也會存在于血清中,亦是造成沉淀物的原因之一。但這些絮狀沉淀物,并不影響血清本身的質量。 
若欲去除這些絮狀沉淀物,可以將血清分裝至無菌離心管內,以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養基內一起過濾。最好不使用過濾的方法去除這些絮狀沉淀物,因為它可能會阻塞過濾膜。
50. 為什么要熱滅活血清? 
加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件,刺激平滑肌收縮,細胞和血小板釋放組胺,激活淋巴細胞和巨噬細胞。在免疫學研究,培養ES細胞、平滑肌細胞時,推薦使用熱滅活血清。 
51. 有必要做熱滅活嗎? 
實驗顯示,經過正確處理的熱滅活血清,對大多數的細胞而言是不需要的。經此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進,或完全沒有任何作用,甚至通常因為高溫處理影響了血清的質量,而造成細胞生長速率的降低。而經過熱處理的血清,沉淀物的形成會顯著的增多,這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察,像是“小黑點”,常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染,而把血清放在37環境中,又會使此沉淀物更增多,使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。 
若非必須,可以不需要做熱處理這一步。不但節省時間,更確保血清的質量! 
52. 為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現沉淀? 
有些胎牛血清產品沒有預老化,儲存在2-8時,血清中的各種蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應該不會影響血清的質量。推薦在-20儲存胎牛血清,避免反復凍融。 
53. 如何避免沉淀物的產生? 
我們建議您在使用血清的時候,注意下列的操作: 
(1)解凍血清時,請按照所建議的逐步解凍法(-20至4至室溫),若血清解凍時改變的溫度太大(如-20至37),非常容易產生沉淀物。 
(2)解凍血清時,請隨時將之搖晃均勻,使溫度及成分均一,減少沉淀的發生。 
(3)請勿將血清置于37太久。若在37放置太久,血清會變得混濁,同時血清中許多較不穩定的成分也會因此受到損害,而影響血清的質量。 
(4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以無須做此步驟。 
(5)若必須做血清的熱滅活,請遵守56,30分鐘的原則,并且隨時搖晃均勻。溫度過高,時間過久或搖晃不均勻,都會造成沉淀物的增多。
                            細胞培養常見問題解答(FAQ)
1 冷凍管應如何解凍? 
取出冷凍管后, 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍, 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化, 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿, 否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時, 必須注意安全, 預防冷凍管之爆裂。 
2 細胞冷凍管解凍培養時, 是否應馬上去除DMSO? 
除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外, 絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞), 在解凍之后, 應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中, 待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可, 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。 
3 可否使用與原先培養條件不同之培養基? 
不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基, 若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基, 細胞大都無法立即適應, 造成細胞無法存活。 
4 可否使用與原先培養條件不同之血清種類? 
不能。血清是
細胞培養上一個極為重要的營養來源, 所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清, 在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。 
5 何謂FBS, FCS, CS, HS ? 
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 兩者都是指胎牛血清, FCS 乃錯誤的使用字眼, 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。 
6 培養細胞時應使用5 % 或10% CO2?或根本沒有影響? 
一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統, 而培養基中NaHCO3 的含量將決定
細胞培養時應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時,細胞培養時應使用10 % CO2;當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時, 則應使用5 % CO2 培養細胞。 
7 何時須更換培養基? 
視細胞生長密度而定, 或遵照細胞株基本數據上之更換時間,按時更換培養基即可。 
8 培養基中是否須添加抗生素? 除于特殊篩選系統中外, 一般正常培養狀態下, 培養基中不應添加任何抗生素。 
9 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度?應如何處理? 
一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中, 保存于–20 °C,避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低, 并可減少污染之機會。 
10 懸浮性細胞應如何繼代處理? 
一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中, 稀釋細胞濃度即可, 若培養液太多時, 可將培養角瓶口端稍微抬高, 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶, 加入新鮮培養基稀釋至適當濃度, 重復前述步驟即可。 
11 欲將一般動物細胞離心下來,其離心速率應為多少轉速? 
欲回收動物細胞, 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm),5 - 10 分鐘, 過高之轉速, 將造成細胞死亡。 
12 細胞之接種密度為何? 
依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。 
13 細胞冷凍培養基之成份為何? 
動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意:由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能, 故不可將DMSO 直接加入細胞液中, 必須使用前先行配制完成。 
14 DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何? 
冷凍保存使用之DMSO 等級, 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650), 其本身即為無菌狀況, 第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中, 保存于4°C, 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質, 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO, 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。 
15 冷凍保存細胞之方法? 
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。 
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時, 以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微 
降低一些。 
16 細胞欲冷凍保存時, 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度? 
冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial, 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。 
17 應如何避免細胞污染? 
細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之最好方法。 
18 如果細胞發生微生物污染時,應如何處理? 
直接滅菌后丟棄之。
19 支原體(mycoplasma) 污染的細胞, 是否能以肉眼觀察出異狀? 
不能。除極有經驗之專家外,大多數遭受支原體污染的細胞株, 
無法以其外觀分辨之。 
20 支原體污染會對細胞培養有何影響? 
支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數, 代謝及研究之任一數據。故進行實驗前,必須確認細胞為mycoplasma-free,實驗結果之數據方有意義。 
21 偵測出細胞株有支原體污染時, 該如何處理? 
直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細胞株。 
22 CO2 培養箱之水盤如何保持清潔? 
定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。 
23 為何培養基保存于4 °C 冰箱中, 顏色會偏暗紅色, 且pH值會越來越偏堿性? 
培養基保存于4 °C 冰箱中, 培養基內之CO2 會逐漸溢出,造成培養基越來越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果, 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時, 可以通入無菌過濾之CO2, 以調整pH 值。 
24 各種
細胞培養用的dish,flask是否均相同? 
不同廠牌的dish 或flask, 其所coating 的polymer 不同, 制造程序亦不同, 雖對大部分細胞沒有太大之影響, 惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。 
25 購買之細胞冷凍管經解凍后,為何會發生細胞數目太少之情形? 
研究人員在冷凍細胞之培養時出現細胞數目太少, 大都是因為離心過程操作上的失誤, 造成細胞的物理性損傷, 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心, 應待細胞生長隔夜后再更換培養基即可。 
26 購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因? 
研究人員在
細胞培養時出現存活率不佳, 常見原因可歸納為:培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后, 加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于–80 °C 太久。 
27 收到之冷凍管瓶身破裂,瓶蓋有裂紋,或瓶蓋脫落之原因? 
冷凍管瓶蓋裂紋,或瓶身破裂,可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當,造成冷凍管裂損,建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫,乃因熱脹冷縮之物理現象,冷凍管有可能因此而造成細胞污染,故冷凍管于放入和取出液氮桶時,均應立刻將冷凍管再一次扭緊。
細胞培養常見問題及解答 
4.GlutaMAX-I是什么?培養細胞如何利用GlutaMAX-I?這個二肽有多穩定? 
    GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物,將其不穩定的α-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。
    GlutaMAX-I二肽非常穩定,即使在121磅滅菌20分鐘,GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎完全降解。
5.為什么培養基中可以省去加酚紅? 
    酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用(特別是雌激素)。為避免固醇類反應,培養細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養基。
6.如何用臺盼蘭計數活細胞? 
    用無血清培養基把細胞懸液稀釋到200-2000個/毫升,在0.1毫升的細胞中加入0.1毫升的0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻,數分鐘后,用血球計數板計數細胞。活細胞排斥臺盼蘭,因而染成藍色的細胞是死細胞。
7.如何消除組織培養的污染?
    當重要的培養污染時,研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母,把污染細胞與其它細胞系隔離開,用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺,檢查HEPA過濾器。
    高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性,因而,做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。
1)在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞,稀釋到常規細胞傳代的濃度。
2)分散細胞懸液到多孔培養板中,或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內,把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。
3)每天觀測細胞毒性指標,如脫落,出現空泡,匯合度下降和變圓。
4)確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2-3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2-3代。
5)在無抗生素的培養基中培養細胞一代。
6)重復步驟4。
7)在無抗生素的培養基中培養4-6代,確定污染是否以已被消除。
9.Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養箱。原因是什么?Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)和Earle’s平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別? 
    HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,碳酸氫鈉的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中,溶液會變堿,Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織,需要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織,用Hanks液就可以了。
10.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差別?
    Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執行的所有的標準檢驗程序,而且除了這些標準檢測,Certified胎牛血清還有如下一些附加的檢測:
End-Point Determination of Endotoxin Content
噬菌體檢驗
生物化學檢測 
激素的檢測
血紅蛋白檢測
Sf9 細胞生長促進及方法學檢測
11.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么? 
    二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前,用EDTA清洗細胞,以消除來自培養基中所有的二價離子。
12.制備 lipid-DNA的方法會影響轉染效率嗎? 
    是的。對于LIPOFECTAMlNE Reagent,稀釋試劑在100μl OPTI-MEM中,稀釋DNA在100μl OPTI-MEM中。混合兩種溶液在室溫下孵育15分鐘。對于LIPOFECTIN Reagent,在加入DNA溶液前允許稀釋的試劑和培養基孵育至少30分鐘可以增加3倍的效率。確保復合物在沒有血清的情況下形成。孵育15分鐘后,在復合物中加入含有血清的培養基(800μl)。(注意以上是35mm培養皿使用體積)。對于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA應該在與脂質體混合之前首先與Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步驟允許在一個很小的體積下混合DNA和脂質體,接下來可以不需要換培養基的情況下直接加入。
13.我使用SF900 時,細胞生長良好,但是為什么我的蛋白產物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時效果好? 
    如果目的蛋白是一個后期蛋白,它將與蛋白酶一起表達,這些蛋白酶將會作用于目的蛋白。在加有血清的培養基中,這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白,從而使目的蛋白產品保持完好。在無血清配方中,蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題,加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清(少于1%),讓血清給蛋白酶提供作用底物。 
14.如何檢測內毒素(熱源)水平? 
    LAL(Limulus Amebocyte Lysate)試驗是可用的最敏感和特異的檢測細菌內毒素的方法。Levin和Bang 發現細菌可引起鱟(Limulus polyphemus)血管內的凝集作用。內毒素啟動一個細胞內酶原系統(絲氨酸蛋白酶級聯反應系統),通過修飾凝集素,產生一種透明的膠,LAL中的凝固蛋白,從而,形成不可溶的基質。LAL試劑緩沖的鱟(血細胞)裂解物。
胎牛血清的內毒素檢測是在Grand Island,按照手冊上Gel-clot 方法進行的。在對血清產品進行內毒素檢測前,用無熱源的水1:10稀釋樣品。稀釋樣品沸水育5分鐘,以消除抑制劑。(通常,血液中的內毒素結合成份的出現會抑制凝膠過程,使內毒素不能與LAL反應。樣品預先熱處理可以消除這種抑制作用。) 
15.我可以使用固體形式的Murashige Skog 培養基嗎? 
    如果使用固體形式的培養基,需要加入瓊脂。瓊脂加入前要先滅菌。應該避免MS培養基的直接滅菌,應該高壓滅菌瓊脂溶液,然后把融化的瓊脂溶液加入到MS培養基中。
16. 20下配制的緩沖液,在較高或較低的溫度下PH值會改變嗎?
    對于普通使用的緩沖液,PH值隨溫度變化而變化。
下表列出溫度改變10時,PH值的變化情況
例如 20下配制PH7.4 Tris緩沖液,40時PH值為 7.4-(2x0.310)=6.78
17. 室溫下(25)配制的Tris-HCl溶液,在37使用時PH值是多少?
    緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4,25,37時,不同的PH值。
19. High Five細胞有任何其它名稱嗎?
    High Five細胞也被稱為Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。
20.在High Five無血清培養基中去污劑的濃度是多少? 
    High Five無血清培養基中去污劑的濃度:0.025 g/L Tween-80,1.0 g/L Pluronic Poly-all。 
21.High Five細胞用多大的密度凍存? 
    3.0x10E6 cells/ml 
22.在我的果蠅培養基中發現形成白色沉淀,加熱后溶解。它是什么?對我的細胞有害嗎? 
    可能是谷氨酰胺沉淀,但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培養基中谷氨酰胺的濃度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的濃度比在RPMI 1640中高25倍,而且比谷氨酰胺更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養條件下可以溶解,對實驗不會有不利的影響。 
23.如何從T25瓶中轉移sf9細胞?能用胰蛋白酶消化嗎? 
    我們強力推薦使用脫落細胞的方法,因為這項技術破壞性最小,生活力最高。通過使用巴氏德吸液管,讓細胞上培養基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養瓶。只有在絕對必要的情況下,才使用胰酶消化細胞。
胰酶消化一個T25瓶的sf9細胞:
1)去除培養基。
2) 用2ml 1xPBS(足以覆蓋細胞表面)洗滌細胞,去除PBS.
3) 加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好覆蓋細胞表面)。
4) 37 孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。
5) 向細胞中加入2ml 細胞培養液,移入錐形管,用2ml培養液洗瓶壁,移入同一錐形管中。(培養基中的FBS終止了胰酶的活性。)
6) 離心(1100rpm)沉淀細胞。去除培養基。
7) 用新的培養基重新懸浮細胞。傳代。 
24.在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養時,肝素的使用量是多少? 
    為了防止懸浮培養細胞聚集的形成,使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。 
25.如何評估ES細胞合格的胎牛血清? 
    使用D3 ES細胞。這是一個對于胎牛血清中生長促進、生長抑制和分化因子非常敏感的細胞系。
相關生長效率分析:
    當ES細胞以非常低的密度傳入包含10%胎牛血清的生長培養基中,檢測開始和支持ES細胞克隆的能力。
細胞毒分析:
    當以非常低的密度傳入包含30%胎牛血清的生長培養基中,檢測ES細胞和feeder細胞的生長能力。
相關形態學和分化分析:
    檢測胎牛血清支持未分化ES細胞
克隆的能力。通過堿性磷酸酶活性評估分化程度。未分化的ES細胞小顏色深紅粉紅,分化的細胞較大,豐滿,顏色較淺。
    所有的分析在沒有ESGRO的情況下進行的,培養基中出現ESGRO會掩蓋由胎牛血清所導致的問題。(ESGRO或LIF經常用來保持ES細胞處于未分化狀態。)
    經過培養發現,大約8批中有1批可以用來培養ES細胞。
26.在重新凍存sf9細胞前,它可以傳多少代?隨著傳代的次數的增加,它的感染能力會降低嗎? 
    通常情況當細胞經過30次傳代后,應該返回凍存。無論什么時候記數時,都應該檢查細胞活力。如果超過95%的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍,細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降,它們的感染力將不在是有效的。
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