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定量PCR(Polymerase?Chain?Reaction)技術
合肥博美生物科技有限責任公司 / 2015-03-02

 

定量PCR(Polymerase Chain Reaction)技術
定量PCR(Polymerase Chain Reaction)技術有廣義概念和狹義概念。廣義概念的定量PCR技術是指以外參或內參為標準,通過對PCR終產物的分析或PCR過程的監測,進行PCR起始模板量的定量。
廣義概念下的定量PCR技術可以分為五種類型:
(1)外參法+終產物分析。所謂“外參法”是指樣本與陽性參照在兩個反應容器內反應。這種類型沒有對樣本進行質控監測,易出現假陰假陽結果,沒有監測擴增效率,定量不準。 
(2)內參法+終產物分析。所謂“內參法”是指樣本與陽性參照在一個反應容器內反應。這種類型對樣本進行質控監測,排除假陰結果,但是定量不準。
(3)外標法+過程監測。這種類型監測擴增效率,陽性樣本定量準,但是無法排除假陰結果。
(4)內參法+過程監測。由于樣本與陽性參照在一個容器內反應,用同樣的Taq酶和反應參與物,存在竟爭性抑制,起始模板量濃度高的反應會抑制起始模板量濃度低的反應,所以定量不準。
(5)外標法+過程監測+內對照。這種類型監測擴增效率,陽性樣本定量準,同時排除假陰結果。這種類型是應該提倡的。PCR過程的監測有多種檢測模式。最常用的有三種檢測模式:
(1)R Green I 檢測模式。溫度循環為94—55—72°C三步法,只有引物,無探針,熒光染料鑲嵌在雙股螺旋鏈中間。通過對特定方向的強熒光檢測獲得信號,這種試劑檢測模式易產生非特異信號,且本底光較大。
(2)解探針模式(Taqman)Hydrolysis Probe 。溫度循環為94—60°C二步法,不僅有引物,還有另外一個特異針對擴增模板的探針在引物對之間。在探針相鄰兩個堿基上分別結合兩個熒光染料,一個染料接受激發光得到的能量傳給了第二個染料,接受能量的第二個染料通過發射特征光子回到穩定態。當Taq酶在60°C延伸擴增鏈時,遇到探針,利用Taq酶5`—3`外切酶活性將探針水解成單個堿基,單個堿基之間距離較遠,第一個染料的能量無法傳給第二個染料,只好通過發射特征光子回到穩定態,通過對溶液中第一個染料的熒光檢測獲得信號。這種試劑檢測模式增加了檢測信號的特異性,但是由于利用了Taq酶5`—3`外切酶活性,一般試劑廠家只給Taq酶的聚合酶活性定標,沒有同時給Taq酶5`—3`外切酶活性定標,不同批號試劑之間會給定量帶來差異。另外對探針的熔點溫度(Tm)僅要求其高于60°C,這就使不同試劑盒之間的特異性參差不齊,而且無法做質控檢測。
(3)雜交探針(Hybridization Probes)模式。溫度循環為94—55—72°C三步法,有引物,二個特異針對擴增模板相鄰的探針在引物對之間,在一個探針3`堿基上結合一個熒光染料,在另一個探針5`堿基上結合第二個熒光染料。在55°C時,兩個探針都剛好接合在模板上,第一個染料接受激發光得到的能量傳給了第二個染料,接受能量的第二個染料通過發射特征光子回到穩定態,通過對結合在擴增模板上雙探針中第二個染料的熒光檢測獲得信號。這種試劑檢測模式中熒光信號與特定雜交溫度相關,探針的濃度始終保持不變,因此可以在擴增后檢測熔解曲線作為信號的特異性質控。另外這種試劑檢測模式可以用于點突變檢測。
狹義概念的定量PCR技術(嚴格意義的定量PCR技術)是指用外標法(熒光雜交探針保證特異性)通過監測PCR過程(監測擴增效率)達到精確定量起始模板數的目的,同時以內對照有效排除假陰性結果(擴增效率為零)。在國家沒有出臺陰陽判定標準時,所用PCR系統靈敏度最好達到一個拷貝(一個病毒)。從理論上說,只要有一個拷貝數,樣本就算陽性;一個拷貝數都沒有才算陰性。
 
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